影像学上，肺腺癌（LUAD）中的磨玻璃结节（GGN）和部分实性结节（PSN）在临床表露、生物学特质和预后方面存在显耀异质性。最近的一项计划中，成都中医药大学附庸病院由凤鸣培育团队对LUAD不同影像学表型的异质性及影响肿瘤演变的联系因素进行探讨，通过更始CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs的相对比例和功能景色，为看护TME内的动态均衡和进步免疫诊疗成果提供了潜在的诊疗战术。

著述先容

#1

计划配景

Background

跟着高分辨率低剂量策画机断层扫描的庸俗使用，以肺结节体式检测到的LUAD病例越来越多，其中GGN和PSN是两种最常见的类型。具有GGN特征的早期LUAD术后5年无病糊口率接近100%，而具有更多实性要素的PSN涌现出更高的更始和疾病进展风险。刻下还莫得全面的计划评估GGN和PSN特征对微浸润腺癌（MIA）、浸润性腺癌（IAC）和更始性肺癌（MLC-LUAD的分子和免疫学特征的影响。为了描述GGN和PSN-LUAD的进化轨迹，计划东谈主员为GGN和PSN-LUAD生成了肿瘤组织和简单肺组织在疾病进展各个阶段（MIA/IAC/MLC）的单细胞转录组图谱。这些图谱拿获了LUAD侵袭和更始经由中TME细胞群的异质性，具有不同的辐射学特征。应用公开可用的患者测序数据和多重免疫荧光技艺，计划东谈主员进一步细目了TME细胞的散播模式。在这种庸俗的异质性中，计划东谈主员细目了驱动肿瘤阻难或促进表型的关节TAM亚群-TREM2+TAMs和CXCL9+TAM，并使用类器官和基因剪辑技艺进展了更始其分化的潜在机制。总之，该计划提供了GGN和PSN-LUAD进化轨迹的分子特征的深刻表征，具有伏击的临床真谛。

#2

计划想路

Methods

计划东谈主员揭示了GGN-和PSN-LUAD的不同TME模式，并细目CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs是影响两种影像学表型之间侵袭和更始生态学各异的关节TME亚群。进一步描述了一个由CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs组成的促肿瘤或抗肿瘤变量的高度配合集结，探索了它们的潜在开端，与T细胞和肿瘤细胞的互相作用，以及联系更始基因在不同辐射学亚型LUAD中的抒发模式。该计划为LUAD的异质性提供了新的生物学视力，其影像学特征的种种性可能会影响临床LUAD计划的精确医学进展。

#3

计划适度

Results

1. GGN-和PSN-LUAD的单细胞风光

计划东谈主员集结成都中医药大学附庸病院胸外科和四川省肿瘤病院19例未经诊疗的LUAD患者极新手术切除的肺组织标本，包括4例癌旁简单肺组织标本；GGN-MIA、GGN-IAC和GGN-MLC样本各3份；3份PSN-MIA、3份PSN-IAC和1份PSN-MLC样本。将样品消化成单细胞悬液后进行ScRNA-seq技艺检测，过滤后共赢得188594个细胞，分为12个簇，并使用经典符号基因抒发进行属目，包括T细胞、上皮细胞、B细胞、内皮细胞、巨噬细胞、树突细胞、成纤维细胞、魁梧细胞、中性粒细胞、浆细胞、淋巴内皮细胞和平滑肌细胞。随后，对异质性进行分析发现，PSN-LUAD组和GGN-LUAD组T、B淋巴细胞富集，髓系细胞浸润减少。此外，跟着GGN-LUAD和PSN-LUAD的侵袭和更始发生变化，肿瘤内细胞的组成在组织特异性常住东谈主群中表泄漏各异（图1）。适度标明，不同肿瘤组织阶段细胞组成的各异可能与疾病进展机制联系。

图1 LUAD伴GGN和PSN的影像学特征表露为肿瘤和癌旁组织内的细胞景不雅

2. PSN-和GGN-LUAD侵袭更始经由中上皮细胞和内皮细胞的抒发模式

为了准确分裂TME中的肿瘤细胞和简单上皮细胞，计划东谈主员对31498个上皮细胞进行了降维和聚类分析。通过整合来自拷贝数变异（inferCNV）、CopyKat和谱系特异性基因抒发的信息，告捷地分裂了恶性上皮细胞和非恶性简单上皮细胞。对非恶性简单细胞的分析细目了上皮细胞亚群，包括AT1、AT2、基底细胞、纤毛细胞、棒状细胞和杯状细胞。进一步计划上皮细胞的异质性。继承Cytotrace、cellcyclesing、AddModuleScore等秩序评估恶性肿瘤细胞的特征。Cytotrace评分适度标明肿瘤细胞群表泄漏更强的谱系分化智力，AddModuleScore适度标明肿瘤细胞表泄漏更高的EMT特征。

此外，计划东谈主员不雅察到PSN-LUAD组不同阶段的Cytotrace评分和EMT评分多数高于GGN-LUAD组，标明两组的恶性进程不同。Ki-67在除G0期外的总共细胞周期中均有抒发，Ki-67高抒发是恶性进程较高的记号。染色适度涌现，跟着疾病从MIA进展到IAC期，Ki-67抒发显耀加多，MLC期的Ki-67染色强度进一步显耀加多。此外，在糊口分析中，编码Ki-67的基因MKI67与预后显耀联系。这些数据高出了GGN-和PSN-LUAD不同进展阶段上皮细胞的转录要领异质性，这可能与临床疾病进展联系。内皮细胞是组成淋巴管的伏击细胞类型，可影响肿瘤微环境的养分运输和氧供。检测适度涌现，GGN-和PSN-LUAD在TME中均表泄漏显着的内皮细胞比例裁汰，PSN-LUAD表泄漏更低的内皮细胞比例。为了进一步不雅察内皮细胞不同亚型的变化趋势，计划东谈主员将内皮细胞亚成簇，并将其属目为六种细胞类型：动脉细胞、毛细血管细胞、毛细血管_aerocyte细胞、Tip细胞、静脉细胞和淋巴细胞。Velocity分析涌现Tip细胞定位于Vein内皮细胞和Capillary内皮细胞之间的发育分化轨迹，Cytotrace适度标明Tip细胞具有更强的分化智力。此外，与GGN-LUAD样本比较，在PSN-LUAD样本中不雅察到更高比例的Tip细胞，这可能是临床不雅察到的PSN-LUAD更快的侵袭和更始的潜在机制之一（图2）。

图2 上皮细胞和内皮细胞在GGN- PSN-LUAD侵袭更始经由中的抒发模式

3. 对髓系细胞的详备分析揭示了CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs驱动的免疫微环境生态位更始

为了细目对肿瘤发展至关伏击的髓系细胞，计划东谈主员探索了伏击细胞亚群的功能。发现巨噬细胞组成了一个主要的髓系细胞簇，并阐扬了主要作用。RNA速率涌现，除RTM+TAMs外，其他TAMs均发祥于经典单核细胞，这为计划巨噬细胞分化轨迹提供了表面标的。M1和M2评分涌现，CXCL9+TAMs的M1评分和TREM2+TAMs的M2评分在巨噬细胞亚群中最高。进一步分析发现，TREM2+和CXCL9+TAMs之间存在潜在的拮抗关系。Monocle2分析发现，在GGN-和PSN-LUAD的不同阶段，CXCL9+TAMs的轨迹树表泄漏一致的分化，标明CXCL9+TAMs在LUAD进展的不同阶段表泄漏换取的功能。在单核细胞向CXCL9+TAMs分化经由中，CXCLs显耀上调，其中CXCL9的上调最为显耀。此外，CXCL9+TAMs分化联系基因与免疫更始高度联系。拟时序分析揭示了TREM2+TAMs中的细胞分化异质性，凸显出在景色4和7时，TREM2+TAMs中的SPP1基因抒发水平升高。不同LUAD疾病阶段的细胞水平变化定量适度涌现，在LUAD MIA-IAC阶段，TREM2+TAMs倾向于表露SPP1-特征，而在LUAD-MLC阶段，SPP1+TAMs的比例出现飞腾。PSN-MLC中SPP1+TAMs的比例显耀高于GGN-MLC。此外，计划东谈主员不雅察到TREM2+/SPP1-TAMs中VEGFA基因显耀上调。在肺腺癌浸润的晚期，TREM2+TAMs主要表露为SPP1+的特征。同期，各异基因分析涌现，在TREM2+/SPP1+TAMs中，SPP1、CSTB、GPNMB、CD9和MPP9等基因抒发上调。多重免疫荧光适度涌现肿瘤组织中存在TREM2+/SPP1+TAMs和TREM2+/SPP1-TAMs。这些符号基因的抒发模式相沿对TREM2+TAMs分化通路的意象，并进一步考据了拟时序轨迹分析的准确性（图3）。这些适度标明CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs的转换对LUAD的演变和进展有显耀影响，并可能讲解PSN-LUAD和GGN-LUAD之间不同的发展趋势。

图3 髓系细胞的详备分析

4. 免疫微环境中淋巴样细胞浸润特征的变化及在GGN -和PSN-LUAD进展和更始中的作用

通过比较NC、GGN-MIA、GGN-IAC、GGN-MLC、PSN-MIA、PSN-IAC和PSN-MLC中T细胞比例的变化，揭示T细胞在GGN-LUAD和PSN-MLC侵袭和更始经由中的TME浸润。计划发现，与NC组比较，GGN-MIA、GGN-IAC、PSN-MIA组T细胞比例显着升高。尔后，计划东谈主员左证经典谱系记号物的抒发细目了12个T细胞亚群，不雅察到CD8+Trm细胞比例在GGN-LUAD和PSN-LUAD中握续加多，且在GGN-MLC阶段的比例高于PSN-MLC阶段。计划东谈主员还关心了另一种淋巴细胞谱系细胞类型-B细胞。B细胞被细分为三个簇：运转B细胞、驰念B细胞和浆细胞，对三种B细胞亚型的比例进行分析发现不存在不同组间表型比例的显耀各异，讲明B细胞主导的免疫微环境的变化与组织中B细胞的总体浸润丰采辩论。应用CellChat，计划东谈主员深刻分析了T细胞、B细胞和巨噬细胞亚群在PSN-LUAD和GGN-LUAD进展和更始中的关节作用。发刻下GGN-MIA和GGN-IAC阶段，与CXCL信号通路联系的细胞间互相作用显耀增强，这一时势也在PSN-LUAD的MIA-IAC阶段得到考据。此外，计划东谈主员不雅察到在MLC阶段，CXCL通路在GGN-MLC和PSN-MLC组中活性裁汰。然而，SPP1通路活性在PSN-MLC阶段特异性增强（图4）。计划标明，肿瘤细胞袭取到的SPP1信号主要开端于CXCL9+TAMs除外的细胞，如TREM2+TAMs和RTM+TAMs，其中TREM2+TAMs是PSN-MLC阶段单核细胞源性巨噬细胞比例最高的细胞。

图4免疫微环境中淋巴样细胞浸润特征的变化及在GGN-和PSN-LUAD进展和更始中的作用

5. IFN-γ调控CXCL9+TAMs与CD8+Trm细胞之间的互相作用，影响GGN-和PSN-LUAD侵袭更始的进展

随后，计划东谈主员探索了CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs之间的信号转导在GGN-和PSN-LUAD侵袭和更始中的伏击机制。在CXCL9+TAMs中，IFN-γ反应、炎症反应和P53_PATHWAY等通路愈加活跃；在TREM2+TAMs中，血管生成、EMT和NOTCH_SIGNALING等通路更活跃。IFN-γ反应道路活性的评分适度标明其在CXCL9+TAMs中表泄漏较高的活性。与不同GGN-LUAD分期比较，PSN-LUAD的IFN-γ信号通路活性较低。左证Cellchat分析适度，计划东谈主员评估了在GGN-和PSN-LUAD侵袭和更始经由中IFN-γ信号的开端：GGN-LUAD侵袭经由中，多种免疫细胞开释IFN-γ：CD8+Trm细胞、CD8+GZMK_Teff、CD8+GNLY_Teff和Classical_NK细胞；在PSN-LUAD侵袭经由中，IFN-γ仅由NK细胞和CD8+Trm细胞开释。这讲解了在PSN-LUAD的侵袭阶段，CXCL9+TAMs和CD8+Trm细胞之间的互相作用缓慢。

为了进一步进展IFN-γ对CXCL9+TAMs分化的影响，计划东谈主员对IFN-γ派遣基因、更始CXCL9抒发的高活性转录因子和与CXCL9+TAMs序贯分化联系的基因进行分析，发现STAT1或者反应IFN-γ的指点，并更始下流CXCL9联系基因的抒发，从而影响CXCL9+TAMs的分化。此外，与其他TAMs比较，STAT1在CXCL9+TAMs中表泄漏更高的抒发水平。通过对STAT1和CXCL9在肿瘤发展不同阶段的抒发水平进行联系性分析，计划东谈主员阐明了STAT1和CXCL9之间的调控关系。在对TREM2+TAMs的不同分化阶段（SPP1 +和SPP1-）的分析中，转录因子NFATC1（+）、EGR3（+）、KLF6（+）和MAF（+）在TREM2+/SPP1-TAMs分化阶段表泄漏高活性抒发。都集TREM2+ /SPP1+TAMs和TREM2+/SPP1-TAMs的DEG分析，计划东谈主员发现EGR1、FOSB和STAT3在TREM2+/SPP1-TAMs中显耀上调。此外，计划东谈主员发现BHLHE41（+）和NR1H3（+）不错径直调控SPP1的抒发，在指点TAMs向SPP1+表型发展中起关节作用（图5）。

图5 IFN-γ调控CXCL9+TAMs与CD8+Trm细胞之间的互相作用，影响GGN-和PSN-LUAD侵袭更始的进展

6. 体内考据IFN-γ/STAT1通路在LUAD发生发展中的作用

计划东谈主员分析了1590例原发性LUAD样本，并细目了LUAD中最常见的突变基因，其中TP53（47%）和KrasG12D（36%）是最常见的两个癌基因。从CAG-Cas9-EGFP小鼠肺组织均分离AT2细胞并培养变成肺类器官。然后，sgRNAs和cDNAs被引入这些类器官中，以敲除和过抒发与东谈主类肺腺癌联系的基因(Trp53−/−；KrasG12D)。明场图像涌现WT类器官涌现出组织风雅的囊性结构，Trp53-/-类器官涌现出多层上皮要素，而TK类器官变成了陈列弘远的固体肿块。Ki-67染色涌现TK类器官具有较高的增殖率（图6）。

将经过基因剪辑的TK类器官移植到小鼠肺内，并使用荧光素酶活体成像和小型策画机断层扫描进行监测。活检涌现打针部位单个病灶有特异性绿色荧光卵白（GFP）抒发，请示肿瘤发祥于移植的类器官。HE染色和免疫组化适度涌现，3周时出现早期LUAD，7周时进展为LUAD，11周时恶性进程更高。RNA-seq适度标明，跟着LUAD的发生和进展，免疫细胞浸润迟缓减少，这一发现与单细胞转录组学的适度一致，请示跟着疾病的进展，肿瘤微环境中发生了免疫细胞耗竭。3、7、11周Western blot适度涌现，IFN-γ、STAT1、p-STAT1、CXCL9、CD8卵白抒发水平迟缓裁汰，SPP1、CD44卵白抒发水平迟缓升高。并对3个阶段小鼠血清进行ELISA考据，适度与单细胞转录组学数据一致，标明单细胞转录组学适度的可靠性（图7）。

图6癌前肺类器官中Trp53−/−；KrasG12D驱动基因的生成

图7应用工程化肺类器官在小鼠中设立不同阶段LUAD模子

小结

该计划阐明了GGN-和PSN-LUAD的细胞组成和免疫派遣存在显耀异质性，并进一步揭示了CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs特殊调控基因在LUAD进展不同阶段的各异富集和互相作用模式。IFN-γ通过激活STAT1信号通路和更始CXCL9+TAMs与CD8+Trm之间的互相作用影响GGN-和PSN-LUAD的侵袭和更始。

参考文件

Ren YF, Ma Q, Zeng X, Huang CX, Ren JL, Li F, Tong JJ, He JW, Zhong Y, Tan SY et al: Single-cell RNA sequencing reveals immune microenvironment niche transitions during the invasive and metastatic processes of ground-glass nodules and part-solid nodules in lung adenocarcinoma. Molecular cancer 2024, 23(1):263. DOI: 10.1186/s12943-024-02177-7.

往期推选

IF19.8！南边医科大学白晓春、高学飞团队构建东谈主软骨类器官药物筛选系统，细目软骨再生新靶点

Cancer Cell | 中山大学一附院于君团队发表高水平计划：具核梭杆菌有助于微卫星牢固型结直肠癌的抗PD-1诊疗

Nature、Science都发！告捷开辟毛发皮肤类器官-巨噬细胞共培养模子并创建产前东谈主类皮肤图谱

IF=48.8 | Cancer cell：通过与患者开端的类器官共培养考据TRGC2+ NKT细胞在食管鳞癌免疫诊疗反应中作用

【Cell stem cell】126例赘瘤患者的194个PDTO：揭示肿瘤耐药性与明锐性

伏击进展！福建省立病院陈实团队应用类器官模子探究舒林酸K-80003奈何促进胰腺导管腺癌对AG有计议的增敏开yun体育网